Frågor till laboration efter dag 4

Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.
Southern Blot är en metod i flera steg. Detta gör att den löper större risk att det någonstans på vägen går fel jämfört med PCR. Exempel på felkällor som kan uppkomma vid southern är vid stringenstvätten. Man har helt enkelt inte fått bort ospecifik bunden probe. Det gör att allt DNA på membranet kommer synas vilket man inte önskar.
Även då vi gjorde blockering i pre-hybridiseringssteget. Går det inte rätt till där så kommer hela membranet färgas brunt.
Vid probe tillverkningen kan det inträffa att man kanske inte får någon inmärkt probe, inga antikroppar mot DIG. Detta leder till att man inte kommer se något alls då man detekterar membranet.
PCR är en mer lättanvänd metod då en gen ska detekteras. Du kan på så vis lättare komma underfund med vad anledningen kan vara om du får något som inte ser rimligt ut efter elektroforesen.
Southern är en bra metod då den kan detektera små mängder, detta är även PCR men southern kan detektera ännu mindre mängder än PCR. Detta kunde konstateras då vi under laborations dag 3 inte kunde se något band på den klyvda plasmiden med koncentration 0,005µg efter elektroforesen. Då vi utförde southern kunde den klyvda plasmiden ses på membranet då vi tillsatte substrat.

Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?  
Jag tycker att denna laboration varit riktigt lärorik. Kul att få testa på att göra en southern. Men att hela tiden ligga ett steg före är viktigt. Speciellt då vi under labb dag 3 hoppade mellan flera olika sidor i laborations kompendiumet. Jag känner mig tryggare att vara på labb när det gäller att hitta material, pipettera och även hur viktigt det är att man faktiskt märker sitt material ordentligt.

Att utöva en sån här laboration som hänger ihop under 4 dagar har varit riktigt kul. Man har verkligen hunnit förstå de olika stegen och det är kul att man kan följa sin laboration genom de olika dagarna. Att noggrannheten verkligen är ytterst viktig för att i slutändan under dag 4 se om plasmiden innehöll genen LL37.

Frågor till laboration efter dag 2


Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Vårt plasmidprov innehåller cirka 550bp vilket kan förväntas då vi vill att provet ska innehålla genen LL37.

Vi fick efter elektroforesen ett väldigt fint resultat. Kvalitén på plasmiden är mycket bra.
 Dock måste något ospecifikt bundit då vi fick en smear i den negativa spalten. Men ingen carry-over. Kan det ha varit humant DNA? skulle man få något/några band kan det tyda på att något annat har amplifierats. Om banden uppstår långt ner kan det tyda på att primer inte bundit.



Då man tittar på den positiva spalten så liknar den väldigt mycket vår ”egna prov” spalt. Detta är bra, då vet vi att provet innehåller genen LL37.
När man tittar på den okluvna spalten ser man att plasmiden ligger högt upp vilket den ska göra då den är okluven. Man kan även se ett svagt band lite högre upp, detta kan tyda på att supercoilen tvinnat upp sig.



Nytta av att använda negativ kontrollen är då man får ett positivt svar och man vill vara säker på att det stämmer. Att det kommer från rätt material. 
Anledningen till att man använder den positiva kontrollen är för att veta att man inte får ett positivt falskt svar. 



Vid användning av gelred kan vi se eventuell kromosomal DNA, kontinimation av nukleinsyror men dock kan vi inte se protein. 
Skulle det finnas något RNA kvar i provet så skulle det synas längre ner på gelen. Kromosomalt DNA skulle synas högt över den okluvna spalten.



Vi kan efter denna laboration konstatera att genen LL37 fanns i bakteriesuspention.

Frågor till laborationen efter dag 1

Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
Efter dagens laboration bör RNA, protein och kromosomalt-DNA vara borttaget.
Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?
Resultatet blev att mitt och Amelie Ramströms prov inte innehöll några proteinföroreningar. Då man vill räkna denna kvot använder man A₂₆₀/A_280.
260nm= 0,077A
280nm= 0,040A
Detta ger: 0,077/0,040 ₌ 1,925
Ett värde som motsvarar < 1,8 innebär att provet inte innehåller några proteinföroreningar.
Även koncentrationen av DNA i en plasmid räknades ut då 1 absorbansenhet vid 260nm motsvarar 50µg DNA/ml.
0,077*50 = 3,85       3,85/1000 = 0,00385µg/µL
Eftersom plasmidlösningen är utspädd 100ggr med TE buffert pH 8,0 och vi vill ha reda på plasmid koncentrationen blir slutliga svaret:
0,00385/100 = 0,385 µg/µL

Anledningen till att man väljer att mäta absorbansen vid just 260nm är eftersom där är nukleinsyror maximalt. Denna utnyttjas också då man vill räkna koncentrationen DNA i plasmidlösningen.
Absorbans vid 280nm används då protein har sin maximala absorbans där. Man vill helt enkelt se om det finns något protein kvar i provet vilket man inte hoppas.
Grafen ovan visar på ett ungefär hur våran kurva blev. Formen på kurvan ser rimlig ut då man utför denna typ av laboration. Ligger toppen vid 260nm så kommer man få en kvot runt 1,82. Skulle spektofotometern avläsa vid lägre absorbans än 260nm vilket påverkar koncentrationen så kan det bero på att man förlorat plasmid under de olika stegen i laborationen. Skulle man däremot få en avläsning över 280nm kan man anta att man fått med pellet vid pipettering.
Då avläsning genom att mäta absorbansen inte är 100%. Så är det helt godkänt om man får en aborbans mellan 0,7-0,8 vid 260nm. Samma sak gäller vid beräkning av koncentrationen. Får man ett värde runt 0,0035 så är det användbart.

Inför LL37

Laboration förberedelse klart!