Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
Efter dagens laboration bör RNA, protein och kromosomalt-DNA vara borttaget.
Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?
Resultatet blev att mitt och Amelie Ramströms prov inte innehöll några proteinföroreningar. Då man vill räkna denna kvot använder man A260/A280.
260nm= 0,077A
280nm= 0,040A
Detta ger: 0,077/0,040 = 1,925
Ett värde som motsvarar < 1,8 innebär att provet inte innehåller några proteinföroreningar.
Även koncentrationen av DNA i en plasmid räknades ut då 1 absorbansenhet vid 260nm motsvarar 50µg DNA/ml.
0,077*50 = 3,85 3,85/1000 = 0,00385µg/µL
Eftersom plasmidlösningen är utspädd 100ggr med TE buffert pH 8,0 och vi vill ha reda på plasmid koncentrationen blir slutliga svaret:
0,00385/100 = 0,385 µg/µL
Anledningen till att man väljer att mäta absorbansen vid just 260nm är eftersom där är nukleinsyror maximalt. Denna utnyttjas också då man vill räkna koncentrationen DNA i plasmidlösningen.
Absorbans vid 280nm används då protein har sin maximala absorbans där. Man vill helt enkelt se om det finns något protein kvar i provet vilket man inte hoppas.
Grafen ovan visar på ett ungefär hur våran kurva blev. Formen på kurvan ser rimlig ut då man utför denna typ av laboration. Ligger toppen vid 260nm så kommer man få en kvot runt 1,82. Skulle spektofotometern avläsa vid lägre absorbans än 260nm vilket påverkar koncentrationen så kan det bero på att man förlorat plasmid under de olika stegen i laborationen. Skulle man däremot få en avläsning över 280nm kan man anta att man fått med pellet vid pipettering.
Då avläsning genom att mäta absorbansen inte är 100%. Så är det helt godkänt om man får en aborbans mellan 0,7-0,8 vid 260nm. Samma sak gäller vid beräkning av koncentrationen. Får man ett värde runt 0,0035 så är det användbart.
Hej Carolina!
SvaraRaderaBra diagram!
Du har svarat flesta frågor bra men saknar svar på om plasmiden är ren.
Jag undrar vad du menar med att man har fått pellet vid pipettering när man får en avläsning över 280nm?
Carolina du skrev ”Skulle spektofotometern avläsa vid lägre absorbans än 260nm vilket påverkar koncentrationen så kan det bero på att man förlorat plasmid under de olika stegen i laborationen. Skulle man däremot få en avläsning över 280nm kan man anta att man fått med pellet vid pipettering.”
Enligt laborations protokol skulle vi räkna kvoten med absorbansvärderna vid 260nm/280nm och därmed får man veta om det innehåller protein förorening eller ej och får man reda på DNA koncentration genom att kvoten multipiceras med absorbasn 1,0 som motsvarar 50μg/ml. Min undran är vilket ämne mäter man vid absorbans lägre än 260nm och likaså över 280nm?
Med vänlig hälsning
Mihee
Hej Carolina!
SvaraRaderaDu har inte riktigt svarat på om plasmiden är ren, du har skrivit om ert värde på kvoten och vad det betyder med protein. Är det bara plasmidens dsDNA som finns i ert prov? Eller finns det andra föroreningar än protein?
Bra med bilden. Lätt att förstå vad du skriver och bra diskuterat.
//Sophie
God kväll! :)
SvaraRaderaJag måste börja med att säga att du har vänt "krokodilgapet" åt fel håll! Du har skrivit att en kvot som är mindre än 1,8 (<1,8) innebär att man INTE har en proteinförorening, när det är tvärtom. Om du bara vänder på gapet så blir det bra. :)
Bra jobbat.
//Camilla