Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?
Vårt plasmidprov innehåller cirka 550bp vilket kan förväntas då vi vill att provet ska innehålla genen LL37.
Vi fick efter elektroforesen ett väldigt fint resultat. Kvalitén på plasmiden är mycket bra.
Dock måste något ospecifikt bundit då vi fick en smear i den negativa spalten. Men ingen carry-over. Kan det ha varit humant DNA? skulle man få något/några band kan det tyda på att något annat har amplifierats. Om banden uppstår långt ner kan det tyda på att primer inte bundit.
Då man tittar på den positiva spalten så liknar den väldigt mycket vår ”egna prov” spalt. Detta är bra, då vet vi att provet innehåller genen LL37.
När man tittar på den okluvna spalten ser man att plasmiden ligger högt upp vilket den ska göra då den är okluven. Man kan även se ett svagt band lite högre upp, detta kan tyda på att supercoilen tvinnat upp sig.
Nytta av att använda negativ kontrollen är då man får ett positivt svar och man vill vara säker på att det stämmer. Att det kommer från rätt material.
Anledningen till att man använder den positiva kontrollen är för att veta att man inte får ett positivt falskt svar.
Vid användning av gelred kan vi se eventuell kromosomal DNA, kontinimation av nukleinsyror men dock kan vi inte se protein.
Skulle det finnas något RNA kvar i provet så skulle det synas längre ner på gelen. Kromosomalt DNA skulle synas högt över den okluvna spalten.
Vi kan efter denna laboration konstatera att genen LL37 fanns i bakteriesuspention.
Hej Carolina,
SvaraRaderani har fått en bra plasmidpreparation både vad man kan se av absorbansvärdena och elektroforesen.
Däremot så är det inte så att man önskar en kvot som är högre än 1,8, utan man vill helst ha en kvot som ligger så nära 1,8 som möjligt. Om kvoten är betydligt högre så innebär det att man har något annat än nukleinsyror som absorberar vid 260nm.
Det är bra att du är tydlig med att det är proteinkontamination man kan se genom kvoten 260/280. Du kan ju inte se om det finns annan nukleinsyra i provet mha absorbansmätningen. Det kan du däremot se mha elektroforesen, och den ser ju bra ut.
PCR resultatet ser ju också övertygande ut. Det är svårt att säga vad som hänt i den negativa kontrollen, skulle kanske kunna vara humant DNA.
Du har rätt i det du skriver om den negativa kontrollen. Den positiva kontrollen är däremot till för att vara säker på att ett negativt svar beror på att det inte finns templat i provet och inte pga att något PCR-reagens inte fungerat.
Annica
Bra beskrivet och diskuterat. Lätt att förstå vad som fanns i de olika brunnarna för att du låtit det du skrivit på brunnarna vara med när du scannade. Jag funderade lite över valet att ha de två markörerna bervid varandra, hade det inte varit lättare att se hur stor ditt pcr-amplifikat var om du hade lagt det mitt emellan de två markörerna?
SvaraRadera// Sophie
neej, jag som skrev en så fin kommentar, och nu måste jag börja om från början igen.
SvaraRaderaJa, jag vet inte vad jag kan bidra med utöver vad de andra redan sagt här. Det är bra att du diskuterar vad som kan ha hänt i den negativa kontrollen. Humant DNA kan nog vara en bra gissning - annars har jag ingen aning i alla fall.
Ja, vad ska man säga mer... Annica tog ju upp det mesta, angående den positiva kontrollen, etc. Du kanske minns vad Märit sa om den på föreläsningen? Om man till exempel vill undersöka huruvida en patient lider av någon form av infektion, då behöver man ju verifiera om ett (eventuellt) negativt svar faktiskt är ett sant negativt svar, eller om PCR:en inte lyckats.
Förutom den negativa kontrollen, så ser ju elektroforesen jättebra ut. :)
//Camilla
jag blir sur om den här kommentaren också försvinner...